分离纯化的基本原理 ：

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

     TRIzol试剂是一种新型总RNA抽提试剂，适用于从细胞和组织中快速分离RNA。内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，特点是可同时分离一个样品的RNA\\DNA\\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

操作步骤：

1. 匀浆处理：
a.组织处理  将文蛤的各个组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞　直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA受到DNA的污染。
c.细胞悬液离心收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.由于样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质，因此在2～8℃10000rpm离心1min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3分钟。

5. 2-8℃10000rpm离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。

7. 2～8℃10000rpm离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超过7500rpm离心5min，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10min即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。RNA可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

10.琼脂糖凝胶电泳对提取RNA产物进行检测。

原创作者：上海恒远生物技术发展有限公司