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抗体效价的检测、抗体的纯化你了解多少吗？

点击次数：2946 发布时间：2019/4/26 10:49:01

抗体：机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文缩写为Ig.

抗体的效价：指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

抗体效价的检测（一般用ELISA间接法进行检测）
1）2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释;阳性参照为以前阳性血清或者细胞上清
2）于96空板中每孔适量的抗原，边沿孔应尽量避免使用，会降低细光值,影响结果。于4℃过夜，紧急情况也可以37℃孵育2小时。
3）倒掉抗原，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
4）倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,尽量风干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5）取包好的96孔板，一孔加入阴性参照液50ul，第二孔加入阳性参照液50ul，第三孔加入稀释的抗体（1：500=抗体：封闭稀释液），后面的第四孔到第12孔加入50ul的封闭稀释液，然后取50ul稀释的抗体进行梯度稀释，第12孔取出50ul的液体，保证每孔液体为50ul。再于37℃孵育1 小时。
6）倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的2抗（1：2000），于37℃孵育45分钟。
7）倒掉液体，有洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（A+B等体积配置，现配现用）温室孵育5—20分钟(根据颜色的改变速度)。
8）每孔加入100ul的终止液（0.M草酸），在酶标仪上读取450nm的吸光度。

抗体的纯化。（一般用亲和纯化，这种方法得到的抗体的纯度高一些。）
(1) 亲和柱的制备
1）称取0.3mg溴化QING活化的琼脂糖凝胶加入1mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得1ml溶涨胶。
2）将凝胶转移入纯化柱中，用约30ml 1mmol／L的盐酸洗介质3次。
3）用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤zui hao在几分钟内完成。
4）将溶解在5ml偶联缓冲液中的10-60nmol的配体加入凝胶中，如需测定结合效率一定要取少量陪体溶液待测。
5）温室下轻轻混合摇动2小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。
6）用30ml的偶联缓冲液洗介质一次。
7）加入15ml阻断缓冲液温室孵育2小时或4`C过夜。
8）依次用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液洗介质一次。重复4次步骤8。
9）重复4次步骤8。
10）配体固相化完成，可用于纯化。
11）若不立即使用，用20%的乙醇封存。
（2）抗体的纯化
1）原血清用PBS等体积稀释，混匀1min，5000-10000r／min，4-20离心15分钟，取上清，并留样送检。
2）用层析仪或手工，10倍体积的PBS 2-4ml／min流速清洗平衡柱子。
3）稀释离心完的上清样品，0.5-1ml／min流速上样。
4）上样完后，用15倍体积的PBS2-4ml／min流速清洗平衡柱子，洗去柱子上残留的杂蛋白。
5）用5-10倍体积的Anitibody Elute Buffer C 洗脱结合在亲和柱子上的抗体，分管收集，没管收集1ml并预先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D调PH至中性（PH7-7.5），如果有层析仪也可以根据层析仪紫外吸收峰检测收集。
6）洗脱完毕后，柱子用5倍体积的PBS 2-4mi／min流速清洗平衡。
7）用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
（3）抗体的浓缩
1）一般收集浓度较高的几管洗脱液，无须浓缩，若弄多实在太低（小于0.5mg／ml），则将收集的馏分加和起来。
2）转移入15ml 的超滤管，3500r／min离心20分钟左右（根据要浓缩的体积摸索离心时间），将浓缩好的抗体小心的用移液器取出来。
3）取700ul 浓缩的抗体检测280nm的吸光度，读数不要超过2，用吸光度读数除以1.35，即为抗体的大致浓度。抗体的浓度也可以用（OD280nm-0.35xOD495nm）1.4这个公式计算。浓缩的程度：使抗体的浓度在0.5-1mg／ml之间zuihao。zuihou通过浓度x体积计算抗体的总量。
（4）抗体的保存
抗体中添加40-50%甘油，可以短时间存放于4℃，如需以后使用，一般500ul／管冻存于-20℃或者更低温度的冰箱中。
（5)抗体纯度的鉴定
一般而言，我们在将抗体纯化以后，如果想知道抗体的纯度和浓度究竟怎么样，就需要走个SDS-PAGE电泳。电泳的方法在网上到处都是，在此就不多说了。

原创作者：上海恒远生物技术发展有限公司