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酶联免疫ELISA试剂盒吸附法的起源及原理

阅读次数：1272 发布时间：2015/1/8 9:26:46

酶联免疫吸附法（ELISA）　　原理：ELISA可用于测定抗体，也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体（标记物）； ③酶作用的底物（显色剂）。　　ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原－－待测抗体－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。　　根据检测目的和操作步骤不同，有以下三种类型的常用方法： 3.1间接法此法是测定抗体*常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本（含相应抗体）与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 3.2双抗体夹心法此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加人待检标本（含相应抗原）与之结合。温育后洗涤，加人酶标板中。 3.3竞争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体。加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竟争与固相抗体结合；经过洗涤分离，*后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。一、酶联免疫吸附法测定抗体含量（竞争法） 1、仪器设备酶联免疫检测仪（Bio－550）；酶标板（96孔）；微量注射器。 2、试剂（1）HRP标记羊抗兔Ig G（1:1 000，国产）；标准牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；（2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸馏水稀释至100 mL。（3）稀释液与洗涤液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸馏水加至1000mＬ。（4）封闭液：含0.1%明胶0.01mol/L PBS， pH7.4。（5）邻苯二胺底物溶液（临用前配制）：临用前将Na2HPO4·12H2O 2.9g,柠檬酸0.51g溶于100mL蒸馏水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。（6）终止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸馏水中加入98%浓硫酸76mL混均即可。 3、操作方法（1）将抗原结合在酶标板上。取标准IgG（10mg/mL）用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加标准抗原的两孔为对照，为反应的0%值，将反应板于4℃放置一夜（8个样品，分3个平行，4个100%值孔；共28+2孔）。（2）标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG（10mg/mL）用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中，其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应放置一夜。（3）封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去，进行洗涤，各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min，倒掉，如此重复4次后，在吸水纸上拍干，加封闭液进行封闭，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封闭液）。封闭后，如前述洗涤。（4）向酶标板中加人标准抗原和抗体的混合物。将标准牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶标板孔内，同是4个未加抗原的100%值的平行样也加入酶标板中。37℃放置2h，再洗板4次。（5）加人HRP标记的羊抗兔Ig G。洗涤后每孔加100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗涤。（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗处反应20min后，每孔加人50μL结束反应液以终止反应。（7）吸收测定。用酶联免疫检测仪测定波长为492nm下的吸光值。（8）数据处理。标准曲线是以Ig（标准牛IgG含量）对B/Bo作图，求得线性方程。其中，C为标准牛IgG含量；B为不同浓度标准牛IgG吸收值与0%吸收值之差;Bo为100吸收值与0%吸收值之差。