gel-elongation分析二型脂肪酸合成

型脂肪酸合成（fasii）是必不可少的细菌细胞活力。显着性差异的细菌和人类在组织结构，酶，和所发挥的作用脂肪酸使这一途径的一个有吸引力的目标抗菌药物发现（参。2）。两年销售抗菌药物这一目标的费边酶是三氯生（防腐剂）和异烟肼（一种抗结核剂）（参3 , 4）。天然产品，浅蓝菌素（参考文献5）和thiolactomycin（参考文献6）选择性抑制缩合酶fabh和fabf /乙，二十多年前被发现。新的筛选努力与现有的化学修饰化合物已试图找出更多的选择和有效的抑制剂。确定选择性抑制剂确定在筛选的努力，我们开发gel-elongation试验使用原油细菌裂解液直接确定具体目标的脂肪酸合成酶抑制剂（参。7 , 8）。

材料

试剂

数码地面电视从费雪（bp172-5）；β-巯基乙醇是从仪（161-0710）。[ 2-14c ]丙二酰辅酶A（60毫居里/浓度，珀金埃尔默，nec612），非加太（西格玛，a7303）预处理3毫米数码地面电视的冰上20分钟，等分和储存在- 80摄氏°浅蓝菌素和thiolactomycin购自西格玛。三氯生可以从塑料，003384。尿素，PVD F膜，10三/甘氨酸缓冲液和本地蛋白样品缓冲购自美国伯乐。

设备

凝胶电泳仪，荧光屏和phosphorimager扫描仪

时间

2天。一天一个运行fasii法，解决它的凝胶和夜间转移到PVD F膜蛋白。第二天揭露phosphorscreen蛋白绑定到聚偏氟乙烯膜和扫描图像使用phosphorimager扫描仪

程序

1）fasii gel-elongation法是由preincubating 0.25 - 2µ克大肠杆菌或金黄色葡萄球菌裂解液与串行稀释抑制剂在室温下20分钟在50µ我的缓冲区含有100毫米磷酸钠（7），5毫米，1毫米，1毫米的核苷酸，核苷酸，150µ米数码地面电视，5毫米ß-巯基乙醇，20µ米乙酰辅酶A或n-octanoyl-coa或任何其他酰基辅酶A需要，4%二甲基亚砜，8µ米非加太预处理技术。

2）的反应是由另外的10µ升的水稀释[碳14 ]丙二酰辅酶A，使终浓度为4µ米丙二酰辅酶A。

3）反应是培养在37摄氏°30分钟，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的裂解液60分钟。

4）反应后，10µ我（加10倍µ我原样品缓冲）每个样品直接应用到16 %聚丙烯酰胺凝胶含有一系列0.4米至4米尿素需要。

5）凝胶的解决和转移到聚偏氟乙烯（聚偏二氟乙烯）膜，暴露在荧光屏和可视化利用phosphorimager扫描仪。

故障排除

关键步骤

尿素浓度是至关重要的分离acyl-acps链长度。活动的裂解液中不同的细菌菌株。因此，需要fasii活性试剂需要优化滴定。乙酰辅酶A不是一个理想的基板为金黄色葡萄球菌（参考文献9）。

预期的结果

在细菌中，fabh催化首先缩合反应使用乙酰辅酶A和malonyl-acp产生acetoacetyl-acp。本产品是减少了导弹快艇，脱水的蚕豆/生产c4:1（Δ2）-非加太国家，进而减少了二次费边使butyryl-acp（c4:0-acp）是基fabf /冷凝酶。浅蓝菌素，选择性fabf /乙抑制剂，在200µ克/毫升积累butyryl-acp和thiolactomycin（333µ克/毫升）抑制fabh和fabf /冷凝酶造成轻微的积累butyryl-acp离开一个广大malonyl-acp未。三氯生（100µ克/毫升）治疗导致的积累c4:1（Δ2）-非加太国家由于其抑制法币。在凝胶延长分析利用大肠杆菌提取物（图1），观察抑制与平板霉素（167µ克/毫升）是类似于看到浅蓝菌素，和不同的观察与thiolactomycin和三氯生，表明平板霉素选择目标fabf / B .同样，滴定平板霉素的使用金黄色葡萄球菌的凝胶延长分析，与octanoyl-coa（c8:0）和丙二酰辅酶A作为基板，显示一个集成电路~ 50 ~ 0.2µ克/毫升（图2）。在较高浓度的平板霉素的积累malonyl-acp观察，表明这种抑制剂不fabd一块，丙二酰辅酶A：非加太转酰基酶。低浓度的平板霉素生产部分抑制伸长活动和积累c2n：0-acp

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